Adaptación bioquímica de la rana de la madera, Rana sylvatica, a la tolerancia a la congelación.

Miguel Montero

Introducción

La rana de la madera también denominada Lithobates sylvaticus es una especie de anuro que viven principalmente en Alaska y Canadá capaz de sobrevivir a la congelación en los periodos más fríos del invierno. Por lo general la adaptación para sobrevivir a la congelación la poseen insectos terrestres que viven en zonas frías pero en varios estudios anteriores a este (1984) se observó esta capacidad en vertebrados.

frog_wood

Estos animales pasan el invierno en tierra donde por lo general se ocultan debajo de una capa de hojarasca cubierta por una capa de nieve que hace que la temperatura no baje demasiado aunque si por debajo de los 0 ºC.

En este estudio se han investigado las adaptaciones bioquímicas subyacentes a la tolerancia a la congelación en invierno de la rana de la madera. Para poder llevar a cabo esta “extrema” hibernación estos animales acumulan sustancias (como glucosa o lactosa) que actúan como crioprotectores y les permiten aguantar la congelación extracelular de su cuerpo. Estos compuestos se midieron en diferentes tejidos del animal: en el corazón, el hígado, el riñón y los músculos de las piernas. La producción de glucosa se inicia rápidamente tras la exposición a temperaturas bajo 0 ºC con el catabolismo del glucógeno hepático aparentemente suministrando los crioprotectores necesarios para todos los tejidos.

A parte se midió la actividad de 17 enzimas en el hígado y en el músculo de la pierna. Las enzimas presentaban un aumento de la actividad sobretodo la de la fosforilasa y la de la glucosa-6-fosfatasa. En el hígado los adenilatos y la carga energética que suponen disminuyeron al exponerse a la congelación. En el músculo no se veían afectados estos niveles pero si disminuían las reservas de creatina fosfato.

Con el estudio se quiere ver que adaptaciones presenta esta especie de anuro para sobrevivir a la congelación y además poder sacar conclusiones que puedan ayudar en campos como la medicina. Al final del estudio se concluye que hay una regulación de la glucosa mediante hormonas pancreáticas que podrían ayudar en los casos de diabetes.

Materiales y métodos

Los animales

Las ranas de la madera fueron recogidas durante septiembre de 1982 en los bosques de alrededor de Ottawa. Se mantuvieron a temperatura ambiente (23 ºC) varias semanas y alimentados por grillos.

Se midió el peso medio de las ranas (1.28±0.10g) y en base al tamaño se distinguieron los adultos de los inmaduros (los de más y los de menos de seis meses de edad).

Los experimentos

Se crearon tres grupos de ranas: uno que era el grupo control al que se le mantenía la temperatura ambiente; y tres grupos a los que se les aclimató de manera diferente a las bajas temperaturas. En esos tres grupos experimentales las ranas se mantenían en contenedores con musgo húmedo para mantener los niveles de humedad típicos de su hábitat.

Experimento 1. A uno de los grupos de ranas se les bajó la temperatura 1 ºC cada día desde los 23 ºC hasta los -4 ºC. A -4 ºC se les mantuvo durante dos semanas más. Se tomaron muestras a los 15, 10, 5, 0, -2 y -4 ºC (el primer día y a las dos semanas).

Experimento 2. Las ranas se traspasaron a una cabina que estaba a 3 ºC (una temperatura constante con variación entre 1-4 ºC). Se muestrearon a los animales durante 11 semanas.

Experimento 3. Aclimataron al último grupo de animales durante 12 semanas a 3 ºC. Pasado ese tiempo se transfirieron a una incubadora a 0 ºC, y se fue bajando la temperatura 1 ºC cada día hasta llegar a los cuatro grados bajo cero y tras cuatro días a esa temperatura se hizo el muestreo de los animales.

Al final del experimento los animales se mataban mediante la técnica de “double pithing”. Con esta técnica se pueden diseccionar a la rana, y como poseen respiración cutánea, no alterar demasiado la fisiología del animal a corto plazo y obtener buenos resultados. Se obtuvo de cada animal una muestra de sangre de la aorta al que se le añadía 180 µl hielo frío, ácido perclórico al 6% con EDTA 1 mM. Los tejidos eran rápidamente diseccionados , congelados en nitrógeno líquido y almacenados a -80 ºC hasta su uso. Las ranas del experimento 1 y 2 fueron disecadas en hielo, mientra que las del experimento 3 seis ranas fueron disecadas a -4 ºC (sin coger muestra de sangre) para preservar los niveles de metabolitos en el animal congelado y el resto, disecados en hielo y usadas para medir la actividad enzimática.

Preparación de tejidos para medición de metabolitos

Mediante una primera centrifugación se removieron las proteínas de la sangre, y el ácido sobrenadante se neutralizó con la adición de KOH, imidazol y KCl, al final precipitaba KClO4 que fue retirado mediante una segunda centrifugación. Las muestras obtenidas se guardaron a -20 ºC hasta su uso.

Los tejidos se molieron con nitrógeno líquido y después se traspasaron a tubos de centrífuga metidos en hielo seco. Tras determinar el peso seco de los tejidos por diferencia de pesos con los tubos prepesados de centrífuga, estos tubos se metieron en un baño de hielo seco y metanol a -8 ºC. Se les añadió también una cantidad de ácido perclórico y EDTA y después se homogeneizaron las muestras. Para medir el contenido de glucógeno se separaban unas alícuotas y se centrifugaban a 6000g durante 20 minutos a 4 ºC para retirar el precipitado de proteína. El ácido sobrenadante se neutralizaba y la muestra se guardaba a -80 ºC.

Ensayo con metabolitos

La concentración de metabolitos en sangre y tejidos fue determinada usando ensayos enzimáticos acoplados. El glucógeno, glicerol y sorbitol se determinaron por diferentes métodos. Para medir el nivel de manosa se necesitó añadir fosfomanosa isomerasa .

Determinación de la actividad enzimática

Los tejidos congelados se homogeneizaban rápidamente con diferentes compuestos y se centrifugaban para obtener el sobrenadante con el que se determinaba la actividad de las enzimas.

Todas las actividades se determinaron a 23 ºC usando un espectofotómetro de registro. Las condiciones óptimas de cada ensayo se determinaban para cada enzima del hígado y del músculo.

Las enzimas a las que se les midió la actividad fueron: fosofrilasa, hexoquinasa, glucosa-6-P deshidrogenasa, 6-fosfogluconato deshidrogenasa, glucosa-6-fosfatasa, fosfofructoquinasa, fructosa-1,6-bifosfatasa, glicerol-3-P deshidrogenasa, piruvato quinasa, lactato deshidrogenasa, citrato sintasa, malato deshidrogenasa, isocitrato deshidrogenasa dependiente de NADP, 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa, glutamato deshidrogenasa y proteínas solubles.

Resultados

Congelación

La congelación extracelular en R. sylvatica ocurre cuando la temperatura ambiente disminuye hasta aproximadamente -2 ºC, un valor que coincide bien con el punto de sobre enfriamiento de -1.9 ºC reportado por Schmid. Evidencias externas de la congelación incluían rigidez en las extremidades, abdomen sólido y ojos opacos. Internamente, los cristales de hielo se encontraron alrededor de los músculos de las piernas y rellenando la cavidad abdominal.

La supervivencia de los animales fue del 100% durante los dos primeros días a -4 ºC y cuatro de las ocho ranas sobrevivieron durante 11 días a -6 ºC. Las ranas se diseccionaban a -4 ºC para prevenir la descongelación. Se vio que ninguno de los órganos (corazón, hígado, intestino, etc) estaba congelados sino que tenían alrededor cristales de hielo.

A las ranas que se les permitió descongelar a 3 ºC, tardaron 4 horas, pero necesitaron de 24 para responder a estímulos y empezar moverse.

Aclimatación a baja temperatura y crioprotectores

La glucosa era el principal compuesto que se acumulaba y funcionaba como crioprotector. En la sangre se registraron niveles de hasta 325 µmol/ml. No se detectaron otros crioprotectores potenciales tales como el sorbitol, la fructosa o la manosa. Los niveles medios de glucosa en sangre fueron de 2.89±0.44 µmol/ml en las ranas control a 23 ºC.

En el experimento 1 hasta pasados los 5 ºC las ranas no variaron su concentración de glucosa en sangre (2.36±0.19 µmol/ml), y cuando la temperatura llegaba a los 0 ºC la glucosa en sangre empezaba a elevarse en todas las ranas (4.77±1.03 µmol/ml).

En el experimento 2 se encontró algo parecido: expuestas las ranas a 3 ºC los niveles de glucosa permanecieron constantes ( 2.43±0.35 µmol/ml).

La glucosa en sangre de los animales congelados era de media de 214±15.6 µmol/ml. Los niveles de glucosa no parecían cambiar significativamente con el tiempo (1, 3 o 11 días) a -4 ºC sugiriendo que la glucosa se liberaba a la sangre probablemente ocurriendo en el rango de temperaturas de 0º a -2 ºC antes de que la congelación extracelular ocurriera.

En las tablas 1, 2 y 3 se pueden ver los niveles de glucosa en diferentes órganos y como aumentan por la congelación. En todos los tejidos medidos (corazón, hígado, riñón y músculo) aumentaba la concentración de glucosa, además, los niveles de glucosa en los tejidos del corazón y del riñón fueron similares a los encontrados en la sangre. En el hígado la concentración de glucosa es el doble que la de la sangre que se puede deber a una continua síntesis de glucosa en el hígado a temperaturas menores a las cuales la congelación extracelular tiene lugar.

tablas

Exposición a la congelación y niveles de metabolitos en los tejidos

Los niveles bajos de glucógeno en el hígado pueden indicar que es la fuente de carbohidratos para la producción de crioprotectores de glucosa (los niveles de glucosa bajan desde 834 µmol/g en el experimento 2 a 100 µmol/g en las ranas del experimento 3). En el resto de tejidos los niveles de glucógeno se mantienen constantes aunque haya un aumento de glucosa.

Que el hígado sea la fuente de crioprotectores esta también constatada por los datos de la Fig.1; con el tiempo a -4 ºC, el contenido de glucosa en el hígado continua incrementándose mientras que los niveles de glucosa en sangre y músculos muestran una pequeña alteración.

Todos los tejidos acumulaban lactato sugiriendo una fuerte dependencia a la producción energética glicolítica durante la congelación. El músculo de la pierna también confiaba en su almacén de fosfágeno para energía durante la congelación. El hígado la variación se ve en los adenilatos. Otros compuestos que se esperaban que pudieran variar significativamente debido a que en invertebrados lo hacen no fue así en las ranas.

Exposición a la congelación y actividad enzimática en los tejidos

En las tablas 4 y 5 se pueden ver las variaciones de las actividades de todas las enzimas que se midieron en los tejidos del hígado y del músculo. Las ranas control se tomaron las del experimento 2 y las ranas expuestas a la congelación las del experimento 3.

tablas 2

Las enzimas escogidas son las representantes de varias rutas principales metabólicas (glucolisis, el ciclo del ácido tricarboxílico, el ciclo de las pentosas fosfato, la gluconeogénesis, la oxidación de ácidos grasos y el metabolismo de aminoácidos).

En el músculo de la pierna la exposición a la congelación no tenía efectos en la actividad de la mayoría de las enzimas. Además, el contenido de proteínas solubles en el músculo no fue alterado. Actividades de la glucosa-6-fosfatasa y la fosforilasa se incrementaron un 70 y 49%, respectivamente, pero el porcentaje de fosforilasa en la forma a permaneció en el 35%.

Las actividades de las enzimas en el hígado aumentaron significativamente por la exposición a la congelación. La mayoría de las enzimas mostraron un aumento en la actividad del 30-90%. Un aumento global del contenido de proteínas solubles del 55%, fue también encontrado. Cuatro enzimas incrementaron su actividad en un 140-160%. La actividad de la fosforilasa, sin embargo, mostró un gran aumento en la actividad del 520% en las ranas expuestas a la congelación. Esto fue acompañado con un incremento del porcentaje de fosforilasa de la forma a del 37% al 80 % en aclimatación al frío. Estas alteraciones en la actividad de la fosforilasa podría fuertemente potenciar la degradación del glucógeno para formar la glucosa como crioprotector.

Discusión

EL estudio indica que esta especie de rana y otras especies anuros que hibernan a la congelación pueden sobrevivir a temperaturas bajo cero moderadas (hasta unos 6ºC) que se dan en los refugios de hibernación.

La supervivencia de los animales está aparentemente condicionada por la congelación extracelular.

El crioprotector en R. sylvatica es la glucosa, aunque se encontraron pequeñas cantidades de otros azúcares. La glucosa no es un crioprotector común en los insectos adaptados al frío.

La síntesis de glucosa comienza a partir de los 0 ºC sin necesidad de periodo de aclimatación. En comparación con los insectos que si necesitan aclimatación en inviernos que no sean muy duros las ranas no se llegarían a congelar y no tendrían que gastar energía luego para reconvertir la glucosa, que hubieran acumulado, otra vez en glucógeno.

La actividad de la mayoría de las enzimas del hígado se vieron alteradas en los experimentos al contrario que pasa con los músculos de las piernas. Este aumento de la actividad se puede deber a la exposición a la congelación o a la deshidratación intracelular.

Es en hígado donde se produce el crioprotector y se libera a la sangre para que llegue al resto de los tejidos, la evidencia está en que hay un equilibrio en la concentración de glucosa en sangre y en el riñón y corazón; en la pierna no es así, y se puede deber a que las extremidades se congelan primero y no llega a entrar tanta glucosa al tejido. El hígado supone el 8- 10% del peso del animal por lo que puede ser capaz de realizar esta función, además el dato de la actividad fosforilasa corrobora esta conclusión. No se conoce el mecanismo por el cual la enzima se activa con el frío.

Los niveles acumulados de ácido láctico indican que durante la congelación estos animales realizan un metabolismo anaerobio (glucolisis anaerobia). En el músculo la energía la aportaría la creatina fosfato. En el hígado parte de la energía también la aportaría los adenilatos debido a la acción del AMP deaminasa.

En general, la capacidad de supervivencia de los animales reside en que no se congele intracelularmente el organismo y de que sea capaz de mantener un metabolismo mínimo. El posible órgano limitante de la supervivencia sería el cerebro ya que requiere de un aporte exógeno de sustrato debido al glucógeno limitado que posee almacenado.


Kenneth B. Storey, Janet M. Storey (1984). Biochemical adaption for freezing tolerance in the wood frog, Rana sylvatica. Journal of Comparative Physiology B, 155: 29-36.

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